一、如何判断是否形成包涵体，以及在没有超声破碎仪的情况下如何破碎菌体

- 我尝试了两种裂解液，成分如下：

- 裂解液A：50 mM Tris-HCl pH 8.0、2 mM EDTA、100 mM NaCl、溶菌酶至 100 μg/mL、0.1% Triton X-100

- 裂解液B：50 mM Tris-HCl pH 8.5–9.0、2 mM EDTA、100 mM NaCl、0.5% Triton X-100、1 mg/mL 溶菌酶

- 实验中仍使用现有的破碎设备，效果不佳，甚至使用反复冻融（37°C/−20°C 循环）也未取得理想效果。请问在缺少超声设备时，同行通常采用哪些方法进行细胞裂解？对上述两种裂解液的使用有何建议或替代方案？

- 关于判断裂解是否充分的常用标准，常见有以下几项，请结合经验给出可操作的判断要点：

1) 外观判断：超声前后菌悬液的浑浊度变化；是否从浑浊变为相对清澈。是否需要较长时间才能达到透明？

2) 液体黏滞性：超声处理后菌液滴落时是否不再黏连。是不是因为裂解不充分导致黏稠性较高？液体体积和缓冲液比例对这一判据有何影响？

3) 高速离心：是否通过离心后沉淀的量和质量来判断裂解程度。常用的转速和时间是怎样的？6000 g 10 min 与更高转速相比各自的优缺点是什么？伟德国际1946

4) 染色检测：裂解后对样品进行涂片染色（如革兰氏染色、晶体紫等），显微观察后如何判断裂解是否彻底？具体应看到哪些征象？

- 你们在实际操作中，判断“完全破碎/充分裂解”的标准通常以哪些直观或定量指标为主？

二、在原核表达中，表达载体为 PET 与 pGEX，诱导条件为 37°C、IPTG 0.5 mM、时间 3 小时，表达后检测为包涵体。如何改进以提高可溶性表达

- 为提高可溶性表达，以下哪种策略在实际操作中更具成效，请结合经验给出优先级与注意事项：

1) 降低表达温度（如 20–30°C）

2) 增加诱导时细菌密度（OD600 大于 1.0）

3) 降低启动表达温度（先将菌株降至约 20°C 再诱导）

4) 降低诱导剂浓度（如 IPTG 小于 0.1 mM）

5) 增加培养过程中的通气（培养瓶中放入约 1/3 的培养基并剧烈摇动以提升氧供，抑制包涵体形成）

6) 缩短诱导时间（如 2–4 小时）

- 除了上述策略，请列出你们在实际优化中常用的其他有效做法，以及它们的适用情境。

- 另外，请提供关于进口超声破碎仪的选型要点、常见型号及性能对比的资料要点，方便我进行设备选购和比较。